Generierung von hiPSC-Reporterlinien zur Untersuchung der Entwicklung endokriner Zellen

In diesem Projekt generieren wir hiPSC-Reporterlinien mittels CRISPR/CAS9, mit denen sich die Entwicklung endokriner Zelltypen untersuchen lässt.

Alpha-, Beta- und Delta-Zellen sind endokrine Zellen des Pankreas und spielen für die Regulation des Blutzuckerspiegels eine elementare Rolle. Wie sich die einzelnen Zelltypen aus einem gemeinsamen Vorläufer entwickeln, ist jedoch noch relativ wenig erforscht. Um die Spezifizierung einzelner endokriner Zelltypen besser nachvollziehen zu können, arbeiten wir in diesem Projekt an der Generierung genmodifizierter Zelllinien, mit deren Hilfe einzelne Entwicklungsschritte in Echtzeit beobachtet werden können. Hierzu werden in humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zunächst Doppelstrangbrüche in relevanten Genen mittels CRISPR/Cas9 induziert. Im Anschluss wird die codierende Sequenz des Reportergens eingefügt, zum Beispiel eines fluoreszierenden Proteins. Dies geschieht während des Reparaturprozesses der DNA durch homology-directed repair (HDR) und die Bereitstellung einer artifiziellen Reparaturvorlage. Die so generierten Zelllinien („Reporterlinien“) sollen in Zukunft Aufschluss über die zeitliche Abfolge einzelner Entwicklungsprozesse endokriner Zellen geben und Wege aufzeigen, wie diese manipuliert werden können.

Projektlaufzeit: 2023 – 2024

Dual-Plasmid Strategie zum Knock-in von Reportersequenzen. Nach Einfügen eines Doppelstrangbruchs mittels CRISPR/CAS9 (codiert auf grünem Plasmid) wird die Lücke mit der Reportersequenz des Donorplasmids (rotes Plasmid) gefüllt.

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